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蒋世禄的生物课堂内外

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蛋白质的呈色反应  

2011-05-14 16:01:26|  分类: 教学参考资料 |  标签: |举报 |字号 订阅

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蛋白质的呈色反应

http://blog.sina.com.cn/s/blog_4d9c77690100qfv4.html

1.双缩脲反应

原理:双缩脲(H2NOC-NH-CONH2)是由两分子尿素缩合成的化合物。将尿素加热到180℃,则两分子尿素缩合,放出一分子氮。双缩脲在碱性溶液中能与CuSO4反应生成紫红色络合物,称为双缩脲反应。凡分子中含有两个以上-CONH-键的化合物都呈此反应。因为蛋白质分子中有很多与双缩脲结构相似的肽键,所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应。

试剂:双缩脲试剂

5gNaOH溶于50mL水中;0.5g硫酸铜溶于50mL水中

方法:取1mL样品于试管中,先加入2mLNaOH溶液,振荡摇匀,造成碱性环境,再加入3-4CuSO4,观察现象。

鉴别:反应呈粉红色或紫红色表明有结合态的蛋白质。

2Millow(米伦)反应

原理:米伦试剂能与单酚、双酚和吲哚生物产生颜色,这些反应最初产生的有色物质可能是酚的亚硝基衍生物,经互变异构后成为颜色更深的邻醌肟,最终形成红色稳定产物。

试剂:米伦试剂——60mL浓硝酸(比重1.42)中溶解40g汞(水浴加温可助溶),溶解后加入2倍体积的蒸馏水稀释。静置澄清后,取上清液备用。该试剂制备须在通风橱中进行,防止吸入烟雾。由于有时反应猛烈需使用较大烧杯,少许少许的加入硝酸。

方法:取样品1mL于试管中,加入米伦试剂0.5mL混合,加热,观察其颜色变化。

鉴别:若有酚类蛋白质,则加入米伦试剂后产生白色蛋白质沉淀,加热后变成红色。(该反应不能用来测定尿中的蛋白质,试剂中的汞离子能被尿、无机盐所沉淀,使试剂失效)

3Salkowski蛋白黄反应

原理:含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。该反应是芳香族氨基酸和含有酪氨酸、色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应;笨丙酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

试剂:浓硝酸;10%NaOH溶液:10gNaOH溶于100mL水中

方法:取1mL样品于试管中,加入浓硝酸2mL,反应慢的可略放置或用微火加热。待各管中出现黄色后,于室温下逐滴加入NaOH溶液至碱性,观察颜色变化。

鉴别:加入浓硝酸变黄色后加碱变橙黄色表明其含有芳香族氨基酸。

4.茚三酮反应

原理:在加热条件下,所有氨基酸及具有游离α-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质,只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生红色物质。此反应十分灵敏,根据反应所生成的蓝紫色的深浅,进行比色就可测定样品中氨基酸的含量,也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。茚三酮反应分为两步:第一步是将氨基酸氧化形成CO2NH3和醛,而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮和另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH4~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH值条件下的颜色深浅不同,如果反应液酸度过大甚至会不显色。

试剂0.1%茚三酮乙醇溶液:茚三酮0.1g溶于100mL乙醇中。

方法:取样品溶液(平行样)2mL于试管中,加入2mL茚三酮乙醇溶液,充分混匀后,在沸水浴煮沸2-3min。观察其颜色变化。

鉴别:若由淡黄色变为紫色。说明样品中含有蛋白质。

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